Hai, berikut ini versi bhs Indonesia untuk topik Mengakses Genom
MENGAKSES GENOM
I. Struktur Internal Nukleus
Nukleus memiliki struktur internal kompleks yang berhubungan dengan perannya dalam berbagai aktivitas biokimia. Tidak seperti sitoplasma yang masing-masing kompartemennya diselubungi membran, kompartemen dalam nukleus tidak memiliki membran.
Apabila bagian membran nukleus, DNA dan protein histon disisihkan, maka nukleus merupakan sebuah jaringan kompleks yang terdiri dari serat2 protein dan RNA yang disebut matriks nuklear.
Didalam nukleus, kompleks DNA-protein yang menyusun kromatin bersifat dinamis. Protein-protein nukleus yang berperan dalam ekspresi genom bergerak dari sisi aktif yang satu ke sisi aktif yang lain. Histon linker secara kontinyu terlepas dan terikat kembali pada sisi-sisi pengikatannya dalam genom. Nukleolus merupakan pusat sintesis dan prosesing rRNA.
Domain kromatin
Kromatin adalah kompleks DNA genom dan protein kromosomal dalam nukleus eukariot. Tingkatan struktur kromatin dimulai dari level pengepakan terendah, nukleosom dan serabut 30 nm, sampai struktur kromosom paling kompak, kromosom metafase yang terjadi hanya selama pembelahan nukleus. Setelah pembelahan, seluruh kromosom menjadi kurang kompak dan tidak dapat dibedakan secara individu. Nukleus yang tidak sedang membelah memperlihatkan daerah gelap (heterokromatin) dan daerah terang (eukromatin). Heterokromatin mengandung DNA yang masih relatif kompak dibandingkan eukromatin. Terdapat dua macam heterokromatin, yaitu:
a. Heterokromatin konstitutif: bersifat permanen, merupakan bagian DNA yang tidak mengandung gen, meliputi sentromer dan telomer. Hampir seluruh bagian kromosom Y merupakan daerah heterokromatin.
b. Heterokromatin fakultatif, terdapat pada sebagian sel pada waktu-waktu tertentu, tidak bersifat permanen, Mengandung sebagian gen yang tidak aktif pada sebagian sel dan pada sebagian periode dari siklus sel. Pada saat gen2 ini tdk aktif, DNA menjadi kompak membentuk heterokromatin. Konfigurasi heterokromatin yang kompak menyebabkan protein2 yang berperan dalam ekspresi gen tdk dpt mengakses DNA.
Eukromatin tersebar sepanjang genom eukariot. Diduga eukromatin mengandung gen2 yang aktif sehingga dapat diakses oleh protein2 ekspresi. Didalam daerah eukromatin terdapat loop-loop DNA yang terikat pada matriks nuklear dengan perantaraan segmen DNA yang kaya dengan AT yang disebut matrix-associated regions (MARs) atau scaffold attachment regions (SARs). Loop2 DNA diantara titik-titik pengikatan nuklear matriks disebut domain struktural. Domain fungsional dpt diidentifikasi bila kromatin diberi perlakuan deoksiribonuklease I (e.g. DNAse I). DNAse I tidak dapat mengakses daerah DNA yang kompak. Daerah2 yang sensitif thd DNAse I terletak disepanjang kedua sisi gen2 yang diekspresikan, diduga karena memiliki konfigurasi yang lebih terbuka.
Domain fungsional dibatasi oleh sekuens insulator. Insulator scs (spesialised chromatin structure) dan scs’ misalnya terdapat pada kedua sisi gen hsp70 dari lalat buah.
Insulator memiliki 2 karakteristik: (1) Kemampuan mengatasi efek posisional. Efek posisional adalah variasi ekspresi gen bila suatu gen disisipkan kedalam kromosom eukariot. Secara alamiah dalam proses insersi gen baru dapat menyisip kedalam daerah kromatin yang kompak dimana gen tsb inaktif atau menyisip ke daerah kromatin yang lebih terbuka dimana gen tsb dapat diekspresikan. Insulator scs dan scs’ yang diletakkan mengapit kedua sisi gen untuk warna mata dan disisipkan kedalam kromosom drosopila mampu mengatasi efek posisional. Gen yang diapit oleh insulator tsb selalu diekspresikan dengan kuat. Kontras dengan variabilitas ekspresi ketika gen tsb disisipkan kedalam drosopila tanpa insulator. Diduga insulator dapat mengubah konfigurasi kromatin dan membentuk domain fungsional. (2) Insulator menjaga independensi domain fungsional dan mencegah ‘cross talk’ antara domain2 fungsional yang berurutan. Apabila scs dan scs’ dikeluarkan dari posisi asalnya dan disisipkan diantara sebuah gen dan sekuens regulator bagian upstream dari gen tsb, maka gen tsb tidak lagi dapat merespon sekuens regulator asalnya. Hal ini menunjukkan bahwa dalam posisi normalnya, insulator mencegah suatu gen dipengaruhi oleh regulator lain yang domainnya berdekatan/berurutan dengan gen tsb. Diduga fungsi insulator didukung oleh protein pengikat DNA seperti Su(Hw) pada drosopila yang secara khusus terikat pada insulator.
Beberapa domain fungsional mengandung daerah kontrol lokus yang disebut LCR (locus control region). LCR berperan dalam pembentukan dan mempertahankan domain fungsional yang terbuka. Seperti insulator, LCR dpt mengatasi efek posisional. Tetapi berbeda dengan insulator, LCR juga menstimulasi ekspresi gen-gen yang terdapat didalam domain fungsionalnya. LCR diduga berperan dalam ekspresi gen-gen yang aktif hanya pada jaringan dan tahap perkembangan tertentu. Contoh LCR diantaranya LCR globin, terletak sekitar 12 kb upstream gen-gen globin. Mutasi pada daerah LCR tsb menyebabkan penyakit talasemia. LCR globin mengandung 5 situs DNA hypersenssif. Pada situs ini nukleosom mengalami modifikasi atau absen dan karenanya bersifat aksesibel terhadap protein pengikat DNA. Protein2 inilah yang mengontrol struktur kromatin dalam domain fungsional.
Situs2 yang hipersensitif terhadap DNAse I juga ditemukan dibagian upstream dari setiap gen yang terdapat dalam LCR beta-globin, pada posisi terbentuknya kompleks inisiasi transkripsi dengan DNA. Gen2 beta globin yang berbeda diekspresikan pada tahap perkembangan yang berbeda pada manusia. Ketika gen tsb aktif, daerah pembentukan kompleks insiasi transkripsi ditandai oleh suatu situs hypersensitif. Diduga ada tidaknya nukleosom menentukan ekspresi gen. Ekspresi gen off apabila situs terbentuknya kompleks insiasi transkripsi tertutup oleh nukleosom dan on bila akses ke situs tsb terbuka.
II. Modifikasi Kromosom dan Ekspresi Genom
Di atas telah dijelaskan tentang dua cara bagaimana struktur kromatin mempengaruhi ekspresi gen. Pertama, tingkat pengepakan kromatin menentukan apakah gen-gen dalam kromatin tsb dapat diekspresikan atau tidak. Kedua, apabila suatu gen aksesibel maka transkripsinya dipengaruhi oleh ketepatan dan posisi nukleosom pada daerah pembentukan kompleks inisiasi transkripsi.
II.1. Mengaktifkan genom
Nukleosom menentukan aktivitas genom eukariot, tidak hanya melalui posisinya pada untai DNA, tetapi juga melalui ketepatan struktur kimia protein histon didalam nukleosom sebagai penentu utama tingkat pengepakan kromatin. Modifikasi kromatin terjadi melalui modifikasi histon dan remodeling nukleosom.
A. Modifikasi histon menentukan struktur kromatin
Protein histon dapat mengalami berbagai modifikasi. Salah satunya adalah asetilasi histon, pengikatan grup asetil pada asam amino lisin pada daerah ujung N dari sumbu histon. Asetilasi mengurangi afinitas histon terhadap DNA dan diduga juga mengurangi interaksi antar nukleosom yang akan membentuk serabut kromatin 30 nm. Histon2 pada daerah heterokromatin pada umumnya tidak terasetilasi sementara histon2 pada domain fungsional terasetilasi.
Enzim yang berperan menambahkan gugus acetil pada histon adalah histone acetyl transferase (HAT). Contoh protein HAT adalah Protein Tetrahymena (p55) yang homolog dengan protein yeast GCN5 yang mengaktifkan pembentukan kompleks inisiasi transkripsi. Protein mamalia p300/CBP yang berperan dalam mengaktifkan berbagai gen juga memiliki aktivitas HAT. Jenis sel yang berbeda memiliki pola asetilasi histon yang berbeda.
Didalam nukleus HAT membentuk kompleks multiprotein seperti kompleks ADA dan SAGA pada yeast dan kompleks TFTC pada manusia. Kompleks yang berbeda mengasetilasi histon yang berbeda, sebagian lagi mengasetilasi protein2 lain yang berperan dalam ekspresi genom seperti faktor transkripsi basal TFIIE dan TFIIF.
Bentuk2 modifikasi histon yang lain adalah pengikatan histon dengan grup metil, grup pospat dan dengan protein ubiquitin. Modifikasi ini mempengaruhi struktur kromatin dan berdampak terhadap aktivitas seluler. Posporilasi histon H3 dan histon linker, misalnya, berhubungan dengan pembentukan kromosom metafase; ubiquitinasi histon H2B berhubungan dengan pengaturan siklus sel. Metilasi lisin ke-9 membentuk situs pengikatan bagi protein HP1 yang menginduksi pengepakan kromatin dan membungkam ekspresi gen, tetapi metilasi lisin ke-4 mendorong pembentukan struktur kromatin terbuka. Dalam domain fungsional β-globin, dan diduga dlm domain lainnya, metilasi lysine-4 berhubungan dengan asetilasi histone H3. Kedua tipe modifikasi tersebut dapat bekerjasama untuk mengaktifkan suatu daerah dalam kromatin.
B. Remodeling nukleosom mempengaruhi ekspresi gen
Tipe modifikasi kromatin kedua yang dapat mempengaruhi ekspresi genom adalah remodeling nukleosom, yaitu modifikasi atau reposisioning nukleosom dalam suatu daerah pendek dalam genom, sehingga protein2 pengikat DNA memperoleh akses ke situs2 pengikatannya. Remodeling diinduksi oleh proses yang menggunakan energi yang melemahkan kontak antar nukleosom dan DNA. Tiga macam perubahan dapat terjadi, yaitu:
• Remodeling, perubahan struktur nukleosom tetapi tidak melibatkan perubahan posisi. Bentuk perubahan struktural belum diketahui, tetapi bila diinduksi secara in vitro menghasilkan nukleosom dengan ukuran ganda dan peningkatan sensitivitas DNA terhadap DNase.
- Sliding, atau cis-displacement, pemindahan nukleosom secara fisik di sepanjang molekul DNA
• Transfer, atau trans-displacement, pemindahan nukleosom ke molekul DNA yang lain atau ke bagian yang tidak berurutan pada molekul yang sama.
Protein2 yang berperan dalam remodeling kromatin bekerja bersama dalam suatu kompleks besar. Salah satunya Swi/Snf pada eukariot, tersusun dari sedikitnya 11 protein. Adanya interaksi antara Swi/Snf dan HATs menunjukkan bahwa remodeling nukleosom dapat berhubungan dengan asetilasi histon. Swi/Snf tampaknya tidak memiliki efek menyeluruh pada keseluruhan genom, sementara HATs bekerja pada seluruh genom. Interaksi juga terjadi antara Swi/Snf dan protein yang mentarget sejumlah gen tertentu. Diduga protein2 tsb adalah aktivator2 transkripsi, yang masing2 bersifat spesifik pada sejumlah gen tertentu.
II.2. Membungkam genom
Pembungkaman (silencing) suatu gen tertentu dilakukan dengan membalik efek aktivasi dari asetilasi histon. Deasetilasi histon dan metilasi DNA memiliki efek silencing.
A. Deasetilasi Histon menekan ekspresi gen
Silencing dapat dilakukan dengan membuang grup asetil dari ekor2 histon sehingga membalikan efek aktivasi dari HATs. Hal ini melibatkan peran histone deacetylases (HDACs). Pada ragi terdapat protein Rpd3 yang menekan proses transkripsi.
HDACs terdapat dalam kompleks multiprotein. Salah satunya adalah kompleks Sin3 dari mamalia, yang tersusun atas sedikitnya 7 protein, termasuk HDAC1 and HDAC2, RbAp46 dan RbAp48 yang mampu mengikat histon. RbAp46 dan RbAp48 berhubungan dengan protein retinoblastoma. RbAp46 dan RbAp48 mengontrol proliferasi sel melalui penghambatan ekspresi berbagai gen sampai waktu dibutuhkan. Mutasi RbAp46 dan RbAp48 menyebabkan kanker. Kompleks deasetilasi lain misalnya NuRD pada mamalia dan Sir2 pada ragi.
Study tentang kompleks HDAC menunjukkan adanya keterkaitan antara berbagai mekanisme untuk aktivasi dan silencing genom. Sin3 dan NuRD mengandung protein yang mengikat DNA yang termetilasi. NuRD juga mengandung protein yang sangat mirip dengan komponen kompleks remodeling nukleosom, Swi/Snf dan NuRD secara in vitro dapat berperan sebagai mesin remodeling nukleosom.
B. Silencing genom dengan metilasi DNA
Metilasi DNA dapat pula menekan ekspresi gen. Terdapat hubungan antara metilasi DNA dan modifikasi histon.
Pada eukariot, basa sitosin pada DNA kromosom seringkali mengalami perubahan menjadi 5-metilsitosin dengan penambahan grup metil oleh enzim DNA methyltransferases. Pada vertebrata hingga 10% dari total jumlah sitosin dalam genom mengalami metilasi, pada tanaman metilasi dapat mencapai 30%. Pola metilasi tidak bersifat acak, terbatas pada sekuens 5′-CG-3′ pada mamalia dan 5′-CNG-3′ pada tanaman. Terdapat dua aktivitas metilasi. Pertama: pemeliharaan metilasi (maintenance methylation) yang berperan menambahkan grup metil pada untai DNA baru sesudah replikasi. Aktivitas ini menjamin untai DNA anak memiliki pola metilasi yang sama dengan untai DNA induk. Kedua: de novomethylation, yang menambahkan grup metil pada posisi yang sama sekali baru dan karenanya mengubah pola metilasi suatu daerah lokal dalam genom. Pada mamalia Dnmt1 adalah enzim DNA methyltransferase yang terutama berfungsi untuk maintenance metilasi, sementara Dnmt3a dan Dnmt3b berperan terutama dalam aktivitas de novo methylation.
Metilasi menyebabkan penekanan ekspresi gen. Gen-gen yang aktif terletak pada daerah-daerah yang tidak termetilasi. Pada manusia misalnya, 40-50% dari seluruh gen terletak dekat dengan pulau CpG (CpG islands). Gen-gen yang diekspresikan pada semua jaringan (housekeeping genes) memiliki pulau CpG yang tidak termetilasi, sementara gen-gen yang diekspresikan secara spesifik pada jaringan2 tertentu tidak termetilasi hanya pada jaringan2 dimana gen2 tsb diekspresikan. Pola metilasi dipertahankan setelah pembelahan sel, informasi yang menunjukkan gen-gen mana yang harus diekspresikan diwariskan kepada sel2 anak. Hal ini menjamin pada jaringan yang berdiferensiasi pola ekspresi gen dipertahankan sekalipun jaringan digantikan atau ditambah dengan sel2 yang baru.
Signifikansi metilasi DNA terlihat dalam studi tentang penyakit manusia. Sindrom ICF (immunodeficiency, centromere instability and facial anomalies) berhubungan dengan rendahnya level metilasi berbagai daerah dalam genom dan disebabkan karena mutasi pada gen Dnmt3b. Kondisi sebaliknya, tingginya level metilasi terlihat pada pulau CpG yang menunjukkan perubahan pola ekspresi pada jenis2 kanker tertentu.
Bagaimana metilasi mempengaruhi ekspresi gen? Protein2 pengikat metil (methyl-CpG-binding proteins) (MeCPs) merupakan komponen dari kompleks Sin3 dan NuRD histon deacetylase. Model yang diajukan adalah pulau CpG yang termetilasi merupakan target pengikatan kompleks HDAC yang kemudian melakukan modifikasi kromatin untuk membungkam gen-gen di sekitar daerah tersebut.
Metilasi berperan dalam imprinting genom dan inaktivasi kromosom X
Imprinting genom relatif tidak umum tetapi penting dalam genom mamalia. Dalam hal ini hanya satu dari sepasang gen pada kromosom homolog yang diploid yang diekspresikan. Gen lainnya dibungkam melalui metilasi. Dalam beberapa kasus, gen2 yang tidak aktif merupakan gen maternal.. dalam kasus2 yang lain gen-gen paternal. Sebanyak 30 gen pada manusia dan tikus menunjukkan fenomena imprinting. Sebagai contoh, Igf2 yang mengkode faktor tumbuh dan berperan dalam signaling antar sel. Pada tikus, hanya gen paternal yang aktif. Pada kromosom yang diwariskan dari ibu, berbagai segmen DNA yang terletak di daerah Igf2 mengalami metilasi sehingga mencegah ekspresi gen Igf2. Gen imprint lainnya, H19, terletak 90 kb dari Igf2 . Imprinting terjadi sebaliknya dimana gen maternal aktif dan gen paternal tidak aktif. Diduga imprinting berperan dalam perkembangan organisme. Tikus partenogenetik sistetis yang memiliki 2 kopi genom maternal tidak dapat berkembang sempurna.
Inaktivasi kromosom X adalah kasus khusus imprinting dimana terjadi total inaktivasi pada salah satu kromosom X mamalia betina. Karena betina memiliki 2 kromosom X dan jantan satu, maka bila kedua kromosom X pada individu betina aktif maka akan terdapat 2 x lipat protein2 yang dikodekan oleh gen2 pada kromosom X. Untuk menghindari hal ini maka salah satu kromosom X betina diinaktifkan. Pada nukleus kromosom X inaktif tampak sebagai struktur kompak yang disebut Barr body, seluruhnya terdiri atas heterokromatin. Silencing terjadi pada awal perkembangan embrio dan dikontrol oleh pusat inaktivasi X yang terdapat pada setiap kromosom X. Pada sel yang mengalami inaktivasi X, pusat inaktivasi pada salah satu kromosom X menginisiasi pembentukan heterokromatin dengan kekecualian pada beberapa segmen pendek yang mengandung sejumlah kecil gen yang tetap aktif. Inaktivasi X bersifat menurun dan diperlihatkan oleh semua sel yang berasal dari kromosom X yang mengalami inaktivasi. Mekanisme inaktivasi tergantung pada:
• Gen Xist, terdapat pada pusat inaktivasi yang ditranskripsikan menjadi 25-kb non-coding RNA, berfungsi dalam pembentukan heterokromatin;
- Penggantian histon H2A dengan histon khusus, macroH2A1
- Diasetilasi histon H4 seperti yang terjadi pada heterokromatin;
• Peningkatan metilasi sekuens DNA tertentu.
